Memantau Kesehatan Organ Padat Setelah Transplantasi Menggunakan DNA Bebas Sel

Diagnostik berdasarkan cfDNA dapat membuat biopsi jaringan menjadi usang
Costly and invasive tissue biopsies to detect allograft rejection after transplantation have numerous limitations. Biopsi jaringan yang mahal dan invasif untuk mendeteksi penolakan allograft setelah transplantasi memiliki banyak keterbatasan. Assays based on cell-free DNA (cfDNA)—circulating fragments of DNA released from cells, tissues, and organs as they undergo natural cell death—have been intensively studied recently and could ultimately improve our ability to detect rejection, implement earlier changes in management, and even enhance the long-term survival of transplanted organs. Tes berdasarkan DNA bebas sel (cfDNA) —sirkulasi fragmen DNA yang dilepaskan dari sel, jaringan, dan organ saat mereka mengalami kematian sel alami — telah dipelajari secara intensif baru-baru ini dan pada akhirnya dapat meningkatkan kemampuan kita untuk mendeteksi penolakan, mengimplementasikan perubahan sebelumnya dalam manajemen , dan bahkan meningkatkan kelangsungan hidup jangka panjang organ yang dicangkok.
CfDNA assays that circumvent the need for whole-genome sequencing (WGS) and the need for a priori knowledge of donor and/or recipient genotypes have powerful logistical advantages and are currently under clinical scrutiny. Tes CfDNA yang mengelak dari kebutuhan untuk sekuensing genom keseluruhan (WGS) dan kebutuhan untuk pengetahuan apriori donor dan / atau genotipe penerima memiliki keunggulan logistik yang kuat dan saat ini sedang dalam pengawasan klinis. In addition, improving knowledge of the organ-specific kinetics of donor-derived cfDNA (dd-cfDNA) following transplantation has also helped optimize these assays. Selain itu, meningkatkan pengetahuan tentang kinetika organ spesifik dari cfDNA yang diturunkan donor (dd-cfDNA) setelah transplantasi juga telah membantu mengoptimalkan tes ini. Laboratories also have introduced alternative methods for quantifying dd-cfDNA, such as digital droplet polymerase chain reaction (PCR) and organ-specific DNA methylation patterns. Laboratorium juga telah memperkenalkan metode alternatif untuk mengukur dd-cfDNA, seperti digital droplet polymerase chain reaction (PCR) dan pola metilasi DNA spesifik organ. As such, the field of minimally invasive diagnostics based upon cfDNA is increasingly promising, one day potentially replacing traditional tissue biopsies. Dengan demikian, bidang diagnostik invasif minimal berdasarkan cfDNA semakin menjanjikan, suatu hari berpotensi menggantikan biopsi jaringan tradisional.
PERAN CFDNA DALAM ORGAN REJECTION
Rejection, referring to injury of a donated organ caused by the recipient's immune system, can cause allograft dysfunction and even patient death. Penolakan, mengacu pada cedera organ yang disumbangkan yang disebabkan oleh sistem kekebalan penerima, dapat menyebabkan disfungsi allograft dan bahkan kematian pasien. T-cell mediated acute cellular rejection (ACR) occurs most often within the first 6 months post-transplant (1). Penolakan seluler akut yang dimediasi sel T (ACR) terjadi paling sering dalam 6 bulan pertama pasca transplantasi (1). ACR involves accumulation of CD4+ and CD8+ T-cells in the interstitial space of the allograft as the recipient's immune system recognizes antigens on the donated organ as foreign. ACR melibatkan akumulasi sel T CD4 + dan CD8 + di ruang interstitial allograft karena sistem kekebalan penerima mengenali antigen pada organ yang disumbangkan sebagai benda asing. These T-cells initiate an immune cascade that ultimately leads to programmed cell death (apoptosis) of the targeted cells. Sel-T ini memulai kaskade imun yang akhirnya mengarah pada kematian sel terprogram (apoptosis) dari sel-sel yang ditargetkan. As these cells die, genomic DNA is cleaved and fragments of dd-cfDNA, measuring approximately 140 base pairs (bp) in length, are released to join the pool of recipient cfDNA in the blood and ultimately excreted in the urine (2). Ketika sel-sel ini mati, DNA genom dibelah dan fragmen dd-cfDNA, berukuran sekitar 140 pasangan basa, dilepaskan untuk bergabung dengan kumpulan cfDNA penerima dalam darah dan akhirnya diekskresikan dalam urin (2).
Circulating cfDNA has recently been leveraged as a diagnostic tool to replace invasive biopsies in other areas of medicine, including analyzing fetal DNA fragments within the maternal circulation to identify genetic abnormalities in utero and sequencing circulating DNA released from tumor cells to identify cancer-related mutations. CfDNA yang beredar baru-baru ini dimanfaatkan sebagai alat diagnostik untuk menggantikan biopsi invasif di bidang kedokteran lainnya, termasuk menganalisis fragmen DNA janin dalam sirkulasi ibu untuk mengidentifikasi kelainan genetik dalam rahim dan mengurutkan sirkulasi DNA yang dilepaskan dari sel tumor untuk mengidentifikasi mutasi terkait kanker. In both these cases as well as in transplantation, high-throughput sequencing that identifies and quantifies DNA sequence differences distinguishes between the two different populations of cfDNA derived from distinct sources (2). Dalam kedua kasus ini serta dalam transplantasi, sekuensing throughput tinggi yang mengidentifikasi dan mengukur perbedaan sekuens DNA membedakan antara dua populasi cfDNA yang berbeda yang berasal dari sumber yang berbeda (2). Three characteristics of cfDNA make it an excellent noninvasive candidate biomarker to detect rejection after solid organ transplantation: It can be obtained from a simple blood draw, its concentration accurately measured, and its nucleotide sequence easily identified. Tiga karakteristik cfDNA menjadikannya kandidat biomarker noninvasif yang sangat baik untuk mendeteksi penolakan setelah transplantasi organ padat: Ia dapat diperoleh dari pengambilan darah sederhana, konsentrasinya diukur secara akurat, dan urutan nukleotida-nya mudah diidentifikasi. Using cfDNA as a biomarker for ACR is also advantageous since it is derived from the injured cells of the donated organ and therefore should represent a direct measure of cell death occurring in the allograft. Menggunakan cfDNA sebagai biomarker untuk ACR juga menguntungkan karena berasal dari sel-sel yang terluka dari organ yang disumbangkan dan karena itu harus mewakili ukuran langsung dari kematian sel yang terjadi di allograft. Furthermore, cfDNA maintains all of the genetic features of the original genomic DNA, allowing the genetic material released from the donated organ to be differentiated from the cfDNA derived from cells of the recipient that are undergoing natural apoptosis (3). Lebih lanjut, cfDNA mempertahankan semua fitur genetik dari DNA genomik asli, yang memungkinkan materi genetik yang dilepaskan dari organ yang disumbangkan dibedakan dari cfDNA yang berasal dari sel-sel penerima yang sedang menjalani apoptosis alami (3).
Frequent and accurate monitoring of allograft health is essential for transplant recipients' long-term survival. Pemantauan kesehatan allograft yang sering dan akurat sangat penting untuk kelangsungan hidup jangka panjang penerima transplantasi. For heart transplantation (HT), endomyocardial biopsy (EMB) is the current gold standard for detecting ACR (4). Untuk transplantasi jantung (HT), biopsi endomiokardial (EMB) adalah standar emas saat ini untuk mendeteksi ACR (4). However, EMBs are costly with significant limitations, many of which are common to all organ biopsies (5-7). Namun, EMB mahal dengan keterbatasan yang signifikan, banyak yang umum untuk semua biopsi organ (5-7). Moreover, the invasive nature of EMBs puts HT patients at risk for complications (6,8,9). Selain itu, sifat invasif EMB menempatkan pasien HT pada risiko komplikasi (6,8,9).
Unfortunately, currently available noninvasive methods including echocardiography or magnetic resonance imaging (MRI) lack sufficient specificity and sensitivity to reliably detect rejection (10-13). Sayangnya, metode noninvasif yang tersedia saat ini termasuk echocardiography atau magnetic resonance imaging (MRI) kurang spesifik dan sensitivitas untuk mendeteksi penolakan secara andal (10-13). Blood-based biomarkers, such as cfDNA, represent a promising alternative that could be readily implemented into clinical practice (14-17). Biomarker berbasis darah, seperti cfDNA, merupakan alternatif yang menjanjikan yang dapat segera diimplementasikan ke dalam praktik klinis (14-17).
KINETIKA CFDNA SELAMA QUIESCENCE DAN REJECTION
Since cfDNA originates from the naturally occurring process of apoptosis, all individuals have detectable levels of cfDNA in their blood (18). Karena cfDNA berasal dari proses apoptosis yang terjadi secara alami, semua individu memiliki tingkat cfDNA yang dapat dideteksi dalam darah mereka (18). For healthy individuals, the majority of circulating cfDNA comes from hematopoietic cells that have undergone natural death related to cellular turnover. Untuk individu yang sehat, sebagian besar cfDNA yang bersirkulasi berasal dari sel hematopoietik yang telah mengalami kematian alami terkait dengan pergantian sel. Levels of cfDNA fluctuate for multiple reasons including infection, surgery, trauma, or even exhaustive exercise (2,19). Tingkat cfDNA berfluktuasi karena berbagai alasan termasuk infeksi, pembedahan, trauma, atau bahkan olahraga lengkap (2,19). Therefore, developing a cfDNA-based assay to detect rejection requires assessing the expected kinetics of dd-cfDNA release into the recipient's circulation post-transplant. Oleh karena itu, mengembangkan uji berbasis cfDNA untuk mendeteksi penolakan memerlukan penilaian kinetika yang diharapkan dari pelepasan dd-cfDNA ke dalam sirkulasi penerima pasca-transplantasi. This consideration is especially important since the release of dd-cfDNA over time post-transplant is organ-specific (20-22). Pertimbangan ini sangat penting karena pelepasan dd-cfDNA dari waktu ke waktu pasca transplantasi adalah spesifik organ (20-22).
For example, at 1 day post-HT the average level of dd-cfDNA is 3.8 ± 2.3% (20). Sebagai contoh, pada 1 hari pasca-HT tingkat rata-rata dd-cfDNA adalah 3,8 ± 2,3% (20). However, by 7 days the level of dd-cfDNA has declined rapidly and remains consistently low (<1%). Namun, dalam 7 hari tingkat dd-cfDNA telah menurun dengan cepat dan tetap rendah secara konsisten (<1%). During an episode of acute rejection in the heart, the level of dd-cfDNA was found to increase to 4%–5% from a baseline of about 0.06% observed during quiescence. Selama episode penolakan akut di jantung, tingkat dd-cfDNA ditemukan meningkat menjadi 4% -5% dari garis dasar sekitar 0,06% diamati selama diam. The kinetics of dd-cfDNA observed in the circulation of HT recipients was similar to that observed after renal transplantation (22). Kinetika dd-cfDNA yang diamati dalam sirkulasi penerima HT mirip dengan yang diamati setelah transplantasi ginjal (22).
In contrast, recipients of bilateral lung transplants were found to have an average dd-cfDNA fraction of 26 ± 14% on the first postoperative day. Sebaliknya, penerima transplantasi paru bilateral ditemukan memiliki fraksi dd-cfDNA rata-rata 26 ± 14% pada hari pertama pasca operasi. Furthermore, the reduction in dd-cfDNA was characterized by levels of dd-cfDNA that declined rapidly within the first week but then slowed and generally remained at 1%–3% (21). Selain itu, pengurangan dd-cfDNA ditandai oleh kadar dd-cfDNA yang menurun dengan cepat dalam minggu pertama tetapi kemudian melambat dan umumnya tetap pada 1% -3% (21). However, similar to heart and kidney transplants during an episode of acute rejection, the level of dd-cfDNA increased significantly, climbing to an average of 14%–15%. Namun, mirip dengan transplantasi jantung dan ginjal selama episode penolakan akut, tingkat dd-cfDNA meningkat secara signifikan, naik ke rata-rata 14% -15%.
Differences in tissue mass and rates of cellular turnover account for this variability in the levels of dd-cfDNA released early post-transplant and during quiescence. Perbedaan dalam massa jaringan dan tingkat pergantian seluler bertanggung jawab atas variabilitas ini dalam tingkat dd-cfDNA yang dirilis awal pasca transplantasi dan selama diam. For example, differences in circulating dd-cfDNA levels in quiescent bilateral and single-lung transplants can be explained by the difference in cellular turnover, being 107 vs. 58 cells/second, respectively (21). Sebagai contoh, perbedaan dalam sirkulasi tingkat dd-cfDNA dalam transplantasi bilateral dan paru-paru diam dapat dijelaskan oleh perbedaan dalam pergantian seluler, masing-masing menjadi 107 vs 58 sel / detik, masing-masing (21). By contrast, in a quiescent transplanted heart, the cellular turnover rate is only 8 cells/second (21-23). Sebaliknya, pada jantung yang dicangkok diam, laju pergantian sel hanya 8 sel / detik (21-23). Thus, an understanding of the expected levels of dd-cfDNA associated with a given solid organ is essential to facilitate development of organ-specific assays that detect rejection. Dengan demikian, pemahaman tentang tingkat yang diharapkan dari dd-cfDNA terkait dengan organ padat yang diberikan sangat penting untuk memfasilitasi pengembangan tes organ spesifik yang mendeteksi penolakan. Once the kinetics of cfDNA release for a particular organ are understood, several methods exist for quantifying the relative amount of dd-cfDNA. Setelah kinetika pelepasan cfDNA untuk organ tertentu dipahami, ada beberapa metode untuk mengukur jumlah relatif dari dd-cfDNA.
STRATEGIES TO DISTINGUISH RECIPIENT- VS. STRATEGI UNTUK MEMBANGKITKAN PENERIMA- VS. DONOR-DERIVED CFDNA CFDNA DONOR-DERIVED
Ketidakcocokan Donor-Penerima Seks
For organ transplants in which the donor is male and the recipient is female, laboratories can leverage this sex mismatch to calculate dd-cfDNA levels from within the recipient's total cfDNA pool (17). Untuk transplantasi organ di mana donor adalah laki-laki dan penerima adalah perempuan, laboratorium dapat memanfaatkan ketidakcocokan seks ini untuk menghitung tingkat dd-cfDNA dari dalam kumpulan cfDNA total penerima (17). Researchers first demonstrated the feasibility of this approach in urine samples taken from female renal transplant recipients who had received a kidney from male donors and when they experienced rejection demonstrated elevated levels of dd-cfDNA in their urine that specifically contained regions found on the Y chromosome (17). Para peneliti pertama menunjukkan kelayakan pendekatan ini dalam sampel urin yang diambil dari penerima transplantasi ginjal wanita yang telah menerima ginjal dari donor laki-laki dan ketika mereka mengalami penolakan menunjukkan peningkatan kadar dd-cfDNA dalam urin mereka yang secara khusus berisi daerah yang ditemukan pada kromosom Y ( 17). Although this approach allows for confident diagnosis of rejection in the allograft, sex-mismatch between the donor and recipient is relatively infrequent and not universally applicable. Meskipun pendekatan ini memungkinkan diagnosis penolakan yang pasti dalam allograft, ketidakcocokan jenis kelamin antara donor dan penerima relatif jarang terjadi dan tidak berlaku secara universal.
Perbedaan Urutan DNA Penerima Donor
An organ transplant can also be regarded as a genome transplant, as the cells within a transplanted organ contain the genetic information of its donor. Transplantasi organ juga dapat dianggap sebagai transplantasi genom, karena sel-sel dalam organ yang ditransplantasikan mengandung informasi genetik donornya. As such, the concept of genome transplant dynamics (GTD) relies on the presence of genetic differences between the donor and recipient at a particular locus, which then can be leveraged to identify the origin of the circulating cfDNA (20-24). Dengan demikian, konsep dinamika transplantasi genom (GTD) bergantung pada adanya perbedaan genetik antara donor dan penerima di lokus tertentu, yang kemudian dapat dimanfaatkan untuk mengidentifikasi asal-usul cfDNA yang beredar (20-24). Ideally, the recipient would be homozygous for a single base (for example, AA) and at the same locus the donor would be homozygous for a different base (for example, GG). Idealnya, penerima akan homozigot untuk basis tunggal (misalnya, AA) dan pada lokus yang sama donor akan homozigot untuk basis yang berbeda (misalnya, GG).
Given the genetic heterogeneity between individuals, tens of thousands of potentially informative loci across the genome can be interrogated using high-throughput sequencing to distinguish dd-cfDNA from recipient cfDNA (20,24). Dengan adanya heterogenitas genetik antar individu, puluhan ribu lokus yang berpotensi informatif di seluruh genom dapat diinterogasi menggunakan sekuensing throughput tinggi untuk membedakan dd-cfDNA dari penerima cfDNA (20,24). This concept was first illustrated using banked samples from cardiac donors to obtain a priori donor genotypes for each donor-recipient pairing. Konsep ini pertama kali diilustrasikan menggunakan sampel yang dibelokkan dari donor jantung untuk mendapatkan genotipe donor priori untuk setiap pasangan donor-penerima. After extracting and sequencing cfDNA from each recipient, the fraction of donor-specific molecules was determined. Setelah mengekstraksi dan mengurutkan cfDNA dari masing-masing penerima, fraksi molekul spesifik donor ditentukan. In samples taken during or immediately preceding a biopsy-proven rejection event, the proportion of donor-specific single nucleotide polymorphisms (SNPs) was found to have increased from <1% to >3%–4% (24). Dalam sampel yang diambil selama atau segera sebelum peristiwa penolakan yang terbukti dengan biopsi, proporsi polimorfisme nukleotida tunggal (SNP) spesifik donor ditemukan meningkat dari <1% menjadi> 3% -4% (24).
This early retrospective study has now been validated prospectively. Studi retrospektif awal ini sekarang telah divalidasi secara prospektif. Adult and pediatric heart and lung transplant recipients were recruited and genotypes for each donor-recipient pair were obtained through WGS with an average of 53,423 informative SNP markers identified (20). Penerima transplantasi jantung dan paru dewasa dan anak direkrut dan genotipe untuk setiap pasangan donor-penerima diperoleh melalui WGS dengan rata-rata 53.423 penanda SNP informatif diidentifikasi (20). Overall, early detection of acute rejection was superior to that of AlloMap, the first Food and Drug Administration-approved non-invasive approach to detecting ACR after HT based on transcriptome analysis (25). Secara keseluruhan, deteksi dini penolakan akut lebih unggul dari AlloMap, pendekatan non-invasif yang disetujui oleh Food and Drug Administration untuk mendeteksi ACR setelah HT berdasarkan analisis transkriptome (25).
Research also has shown that WGS not only provides information about a graft but also a patient's virome and overall state of immunosuppression. Penelitian juga menunjukkan bahwa WGS tidak hanya menyediakan informasi tentang graft tetapi juga virome pasien dan keadaan imunosupresi keseluruhan. This represents a potentially great advantage unobtainable by other assays (26-28). Ini merupakan potensi keuntungan besar yang tidak bisa diperoleh oleh tes lain (26-28).
However, WGS faces challenges that could prevent it from being implemented routinely in clinical practice. Namun, WGS menghadapi tantangan yang dapat mencegahnya diimplementasikan secara rutin dalam praktik klinis. For example, while a recipient's genetic information can be easily obtained, this is not always true for a donor. Misalnya, walaupun informasi genetik penerima dapat dengan mudah diperoleh, ini tidak selalu benar untuk seorang donor. Moreover, WGS is costly, labor intensive, and time-consuming. Selain itu, WGS mahal, padat karya, dan memakan waktu.
An alternative method employs a panel of genotyped polymorphic SNPs identified within the pool of extracted cfDNA thereby eliminating the need for a priori knowledge of a donor's specific genotype (29). Metode alternatif menggunakan panel SNP polimorfik genotipe yang diidentifikasi dalam kumpulan cfDNA yang diekstraksi sehingga menghilangkan kebutuhan akan pengetahuan apriori dari genotipe spesifik donor (29). Unlike kidney and liver transplants, which often occur between closely related individuals, the donor-recipient pairs for heart and lung transplants typically are not related. Tidak seperti transplantasi ginjal dan hati, yang sering terjadi di antara individu-individu yang saling terkait, pasangan donor-penerima untuk transplantasi jantung dan paru biasanya tidak berhubungan. GTD requires genotyping of both the transplant recipient and donor. GTD membutuhkan genotipe penerima transplantasi dan donor. However, in practice, donor genotype information is often unavailable. Namun, dalam praktiknya, informasi genotipe donor seringkali tidak tersedia. Here, we address this issue by developing an algorithm that estimates dd-cfDNA levels in the absence of a donor genotype. Di sini, kami mengatasi masalah ini dengan mengembangkan algoritma yang memperkirakan tingkat dd-cfDNA tanpa adanya genotipe donor. Our algorithm predicts heart and lung allograft rejection with an accuracy that is similar to conventional GTD. Algoritme kami memprediksi penolakan allograft jantung dan paru-paru dengan akurasi yang mirip dengan GTD konvensional. We furthermore refined the algorithm to handle closely related recipients and donors, a scenario that is common in bone marrow and kidney transplantation. Kami selanjutnya menyempurnakan algoritma untuk menangani penerima dan donor yang terkait erat, sebuah skenario yang umum dalam sumsum tulang dan transplantasi ginjal. We show that it is possible to estimate dd-cfDNA in bone marrow transplant patients who are unrelated or who are siblings of the donors, using a hidden Markov model. Kami menunjukkan bahwa adalah mungkin untuk memperkirakan dd-cfDNA pada pasien transplantasi sumsum tulang yang tidak berhubungan atau saudara kandung dari donor, menggunakan model Markov yang tersembunyi. Therefore, algorithms have been developed for heart and lung transplants which assume that the donor's genotype occurs at the same frequency as the general population. Oleh karena itu, algoritma telah dikembangkan untuk transplantasi jantung dan paru-paru yang mengasumsikan bahwa genotipe donor terjadi pada frekuensi yang sama dengan populasi umum. Based on these frequencies and comparison to the known genotype of the recipient, the fraction of dd-cfDNA can be reliably estimated from the total pool of cfDNA isolated from a recipient's plasma sample. Berdasarkan frekuensi ini dan perbandingan dengan genotipe penerima yang diketahui, fraksi dd-cfDNA dapat diestimasi secara andal dari kumpulan total cfDNA yang diisolasi dari sampel plasma penerima.
In the case of lung transplantation, this single-genome model, when compared to the methodology using both donor and recipient genotypes, was found to provide comparable fractions of dd-cfDNA. Dalam kasus transplantasi paru-paru, model genom tunggal ini, bila dibandingkan dengan metodologi yang menggunakan genotip donor dan penerima, ditemukan untuk memberikan fraksi dd-cfDNA yang sebanding. However, when researchers applied this same algorithm to HT, the estimated levels of dd-cfDNA were not as strongly correlated as in lung transplants. Namun, ketika para peneliti menerapkan algoritma yang sama ini untuk HT, tingkat estimasi dd-cfDNA tidak berkorelasi kuat seperti pada transplantasi paru-paru. This might be related to the lower absolute amounts of dd-cfDNA present after HT. Ini mungkin terkait dengan jumlah absolut yang lebih rendah dari dd-cfDNA yang hadir setelah HT. This is another example of organ-specific cfDNA kinetics that can influence assay results and must be taken into account (30). Ini adalah contoh lain dari kinetika cfDNA organ spesifik yang dapat mempengaruhi hasil uji dan harus diperhitungkan (30).
In the case of renal transplantation, prospective studies have been conducted to ascertain the utility of dd-cfDNA levels, identified using known donor-specific SNPs, as a viable marker for rejection. Dalam kasus transplantasi ginjal, studi prospektif telah dilakukan untuk memastikan kegunaan tingkat dd-cfDNA, diidentifikasi menggunakan SNP spesifik donor yang diketahui, sebagai penanda yang layak untuk penolakan. In one such study, 384 kidney recipients were recruited from 14 clinical sites to provide blood samples at scheduled intervals and at times of clinically indicated biopsies (31). Dalam satu studi tersebut, 384 penerima ginjal direkrut dari 14 lokasi klinis untuk memberikan sampel darah pada interval yang dijadwalkan dan pada waktu biopsi yang ditunjukkan secara klinis (31). Overall, the study focused on the correlation between the histology in 107 biopsy specimens from 102 patients and the levels of dd-cfDNA found in matched plasma samples. Secara keseluruhan, penelitian ini berfokus pada korelasi antara histologi dalam 107 spesimen biopsi dari 102 pasien dan tingkat dd-cfDNA yang ditemukan dalam sampel plasma yang cocok. More specifically, 27 biopsy samples from 27 patients with active rejection were obtained along with 80 biopsy samples from 75 patients without active rejection. Lebih khusus, 27 sampel biopsi dari 27 pasien dengan penolakan aktif diperoleh bersama dengan 80 sampel biopsi dari 75 pasien tanpa penolakan aktif.
In this study, active rejection included acute antibody-mediated rejection (AMR), chronic AMR, and ACR. Dalam penelitian ini, penolakan aktif termasuk penolakan akut yang dimediasi antibodi (AMR), AMR kronis, dan ACR. The assay used in this study employed a 1% cutoff for the fraction of dd-cfDNA to indicate the presence or absence of active rejection and was found to have 85% specificity (95% CI, 79%–91%) and 59% sensitivity (95% CI, 44%–74%). Uji yang digunakan dalam penelitian ini menggunakan cutoff 1% untuk fraksi dd-cfDNA untuk menunjukkan ada atau tidak adanya penolakan aktif dan ditemukan memiliki spesifisitas 85% (95% CI, 79% -91%) dan sensitivitas 59% (95% CI, 44% –74%). The sensitivity of this assay was greater for discriminating between active and absent AMR, as the use of a cutoff of 1% dd-cfDNA was found to have an 83% specificity (95% CI, 78%–89%) and 81% sensitivity (95% CI, 67%–100%). Sensitivitas uji ini lebih besar untuk membedakan antara AMR aktif dan tidak ada, karena penggunaan cutoff 1% dd-cfDNA ditemukan memiliki spesifisitas 83% (95% CI, 78% -89%) dan sensitivitas 81% (95% CI, 67% –100%). Notably, in both cases, the sensitivity declined substantially when the fraction of dd-cfDNA exceeded 3%. Khususnya, dalam kedua kasus, sensitivitas menurun secara substansial ketika fraksi dd-cfDNA melebihi 3%.
To improve specificity and sensitivity of a non-invasive cfDNA-based assay to detect rejection following renal transplantation, investigators also have surveyed the absolute amount of dd-cfDNA (32-33). Untuk meningkatkan spesifisitas dan sensitivitas uji berbasis cfDNA non-invasif untuk mendeteksi penolakan setelah transplantasi ginjal, para peneliti juga telah mensurvei jumlah absolut dd-cfDNA (32-33). By interrogating the absolute amount of dd-cfDNA, one can eliminate the artificial changes in the fraction of dd-cfDNA due to increases in total cfDNA levels caused by non-rejection events, such as infection, trauma, or exercise, potentially creating a more accurate assay. Dengan menginterogasi jumlah absolut dari dd-cfDNA, seseorang dapat menghilangkan perubahan buatan dalam fraksi dd-cfDNA karena peningkatan kadar cfDNA total yang disebabkan oleh peristiwa non-penolakan, seperti infeksi, trauma, atau olahraga, yang berpotensi menciptakan lebih banyak lagi pengujian akurat.
To investigate this possibility, one study employed 32 informative copy number variants (CNVs) based on population frequencies, as opposed to relative proportions of donor and recipient SNPs at given loci (32). Untuk menyelidiki kemungkinan ini, satu studi mempekerjakan 32 varian nomor salinan informatif (CNV) berdasarkan frekuensi populasi, yang bertentangan dengan proporsi relatif dari SNP donor dan penerima di lokus yang diberikan (32). All CNVs not present within a recipient's genome but present within the extracted cfDNA were therefore assumed to represent dd-cfDNA. Semua CNV tidak hadir dalam genom penerima tetapi hadir dalam cfDNA yang diekstraksi karena itu diasumsikan mewakili dd-cfDNA.
Interestingly, while the specificity and sensitivity improved overall with the use of absolute dd-cfDNA levels, this assay also had a greater capacity to distinguish between the presence and absence of active AMR, as opposed to cases of active ACR. Menariknya, sementara spesifisitas dan sensitivitas meningkat secara keseluruhan dengan penggunaan tingkat dd-cfDNA absolut, pengujian ini juga memiliki kapasitas yang lebih besar untuk membedakan antara ada dan tidak adanya AMR aktif, yang bertentangan dengan kasus ACR aktif. In addition, serum creatinine levels were not sufficient in discriminating between active rejection and quiescence, likely because it is more indicative of glomerular function as opposed to kidney tissue damage (31-33). Selain itu, kadar kreatinin serum tidak cukup dalam membedakan antara penolakan aktif dan ketenangan, kemungkinan karena lebih menunjukkan fungsi glomerulus dibandingkan dengan kerusakan jaringan ginjal (31-33).
Another study explored the absolute levels of dd-cfDNA in kidney transplant recipients related to levels of tacrolimus, an immunosuppressant (33). Studi lain mengeksplorasi level absolut dari dd-cfDNA pada penerima transplantasi ginjal yang terkait dengan level tacrolimus, imunosupresan (33). Here, the researchers found that the absolute amount of dd-cfDNA was substantially higher in patients with lower tacrolimus levels (<8 μg/L) in comparison to those with higher drug levels. Di sini, para peneliti menemukan bahwa jumlah absolut dari dd-cfDNA secara substansial lebih tinggi pada pasien dengan tingkat tacrolimus yang lebih rendah (<8 μg / L) dibandingkan dengan mereka yang memiliki tingkat obat yang lebih tinggi. These data suggest that dd-cfDNA levels also have the potential to detect allograft injury resulting from inadequate immunosuppression. Data ini menunjukkan bahwa kadar dd-cfDNA juga memiliki potensi untuk mendeteksi cedera allograft akibat imunosupresi yang tidak adekuat.
Laboratories also have proposed alternatives to WGS. Laboratorium juga telah mengusulkan alternatif untuk WGS. Our group explored targeted sequencing of 124 highly polymorphic (minor allele frequency [MAF] >0.4) SNPs using a commercially available panel, next-generation sequencing, and a novel algorithm (34). Grup kami mengeksplorasi sekuensing bertarget dari 124 SNP yang sangat polimorfik (frekuensi alel minor [MAF]> 0,4) menggunakan panel yang tersedia secara komersial, sequencing generasi berikutnya, dan algoritma novel (34). This approach significantly reduced the total amount of sequencing required, decreasing costs and assay time, and enabling rapid analysis. Pendekatan ini secara signifikan mengurangi jumlah total urutan yang diperlukan, mengurangi biaya dan waktu pengujian, dan memungkinkan analisis cepat. However, since this assay relies upon differences in MAF between individuals, it would not be robust for closely related donor–recipient pairs, such as seen in living-related kidney donation. Namun, karena uji ini bergantung pada perbedaan MAF antara individu, itu tidak akan kuat untuk pasangan donor-penerima yang terkait erat, seperti terlihat dalam donasi ginjal terkait hidup. It remains to be validated for detecting moderate or greater rejection events. Itu masih harus divalidasi untuk mendeteksi peristiwa penolakan moderat atau lebih besar.
Laboratories also have explored using polymorphic SNPs to quantify dd-cfDNA combined with the technology of digital droplet PCR (30,35-37). Laboratorium juga telah mengeksplorasi menggunakan SNP polimorfik untuk mengukur dd-cfDNA dikombinasikan dengan teknologi tetesan digital PCR (30,35-37). Using 41 highly polymorphic SNPs, stable kidney and HT recipients showed dd-cfDNA fractions of 2%–3% with stable liver transplant recipients having a level of 7% (35). Menggunakan 41 SNP yang sangat polimorfik, ginjal yang stabil dan penerima HT menunjukkan fraksi dd-cfDNA 2% -3% dengan penerima transplantasi hati yang stabil memiliki level 7% (35).
KESIMPULAN
The use of a costly and invasive tissue biopsy to detect allograft rejection has significant limitations. Penggunaan biopsi jaringan yang mahal dan invasif untuk mendeteksi penolakan allograft memiliki keterbatasan yang signifikan. As such, a minimally invasive assay that can directly and accurately assess the health of the entire transplanted organ represents a holy grail in solid organ transplantation. Dengan demikian, uji invasif minimal yang dapat secara langsung dan akurat menilai kesehatan seluruh organ yang ditransplantasikan merupakan cawan suci dalam transplantasi organ padat.
The use of cfDNA after transplantation has shown some initial promise, but further study and validation is required to improve our understanding of both the basic biology of cfDNA as well as its behavior post-transplant. Penggunaan cfDNA setelah transplantasi telah menunjukkan beberapa harapan awal, tetapi studi lebih lanjut dan validasi diperlukan untuk meningkatkan pemahaman kita tentang biologi dasar cfDNA serta perilakunya pasca-transplantasi. At this time, it is clear that important organ-specific differences exist, and patterns of cfDNA release may also differ depending on the type of rejection event. Pada saat ini, jelas bahwa ada perbedaan spesifik organ yang penting, dan pola pelepasan cfDNA juga mungkin berbeda tergantung pada jenis acara penolakan. However, cfDNA represents one of the most promising technologies yet developed to complement or even ultimately replace the tissue biopsy. Namun, cfDNA merupakan salah satu teknologi paling menjanjikan yang belum dikembangkan untuk melengkapi atau bahkan pada akhirnya menggantikan biopsi jaringan.